张骞出使西域之后，汉帝国于元封三年（公元前108年）出兵攻破楼兰、车师，打败大宛后，在西汉太初四年（公元前101年）在西域设立了“使者校尉”，一方面保障了通往西域诸国的道路安全畅通，尤其是保障其中人烟稀少、艰险重重路段的安全畅通，另一方面令其率士卒数百人在轮台、渠犁一带屯田积谷，以之供应途中出使西域的使者。“使者校尉”应该是汉帝国在西域最早设置的行政机构。
到西汉地节二年（公元前68年），汉帝国派遣侍郎郑吉率兵屯田于车师（今吐鲁番盆地），并令郑吉守护鄯善（今罗布泊一带）以西的丝路南道，也就是统管天山以南的各地区。此后不久，匈奴虚闾权渠单于死，右贤王屠耆堂继承王位，理应继承王位的左贤王之子日逐王先贤掸，于神爵二年（公元前60年）率数万部众投附汉帝国，西汉特派郑吉迎接日逐王，封其为归德侯。是年，为管理统一后的西域，西汉帝国在乌垒城（今轮台县境内）设置了西域都护府，自此正式在西域设官、驻军，并推行政令，开始行使西汉国家主权。西域都护是汉王朝中央政府派遣管理西域的最高军政长官，其级别相当于郡太守，年俸二千石粮食。汉宣帝任命郑吉为第一任西域都护，由其统辖西域诸国，管理屯田，颁行朝廷号令，诸国有乱则发兵征讨。据《汉书•西域传》载，西域都护统辖西域诸国有48国。
在郑吉任西域都护之后，汉元帝时有继任者韩宣、甘延寿，汉成帝时有继任者段会宗、韩立、廉褒、郭舜，汉平帝时有继任者孙建、但钦，新莽时期有继任者李崇。在今阿克苏地区古城中曾出土西域都护李崇的印玺。到了新莽后期，西域内乱，李崇也因此死于龟兹，西域都护府开始废弛。此后至东汉明帝永平十七年（74年），复设西域都护府，任命陈睦为西域都护。然而就在第二年，焉耆和龟兹共谋反叛，屠杀陈睦，西域都护府又被废弛。到了东汉和帝永元三年（91年），班超平定了西域反叛之乱，此后汉王朝任命班超为西域都护，驻扎龟兹。在班超返回洛阳之后，又有任尚和段禧先后为班超的继任者。十余年之后，至东汉安帝永初元年（107年），西域又乱，从此之后，东汉帝国不再复置西域都护府。一直到东汉安帝延光二年（123年），班勇被任命为西域长史，屯驻柳中（高昌壁东南，今吐鲁番城东的阿斯塔那附近），随即平复了西域之乱，龟兹、疏勒、于阗、莎车诸国随即来归附。东汉与西域诸国中断了的统辖关系又得以恢复，自此以后，汉王朝开始以长史行使西域都护的职责。东汉光武帝至安帝期间，丝绸之路历经了“三通三绝”，即三次中断与复通的曲折过程。
概而言之，汉王朝在西域设立西域都护府进行任命官员、派兵驻守、屯田戍边，推行政令等行使王朝主权行政管理，奠定了后世历代中央政权统管西域的基础。西域都护府之设立，打破了西域诸小国林立、互有矛盾的分离状态。在中央政府统辖之下，各地的政治经济文化交流日益频繁，客观上增进了西域各民族间的相互了解与信任，当然也加强了西域与中原内地的密切联系。例如，在西汉末年至东汉年间，西域局势常发生动荡，西域中的小国则会派使者至汉王朝，请求派遣西域都护，以维持西域稳定和平的局势，反映了西域诸国对汉王朝中央政权的信赖，也可以看出汉王朝对西域统辖和经略的历史功绩和意义。正如《后汉书•西域传》描述汉王朝经营西域的成就：“汉世张骞怀致远之略，班超奉封侯之志，终能立功西遐，羁服外域。自兵威之所肃服，财赂之所怀诱，莫不献方奇，纳爰质，露顶肘行，东向而朝天子。故设戊己之官，分任其事；建都护之帅，总领其权。先驯则赏籯金而赐龟绶，后服则系头颡而衅北阙。立屯田于膏腴之野，列邮置于要害之路。驰命走驿，不绝于时日；商胡贩客，日款于塞下。”
汉王朝设立西域都护府统一管辖西域，保证了丝绸之路畅通无阻，它使西域与中原的社会经济产生了持久而良性的互动发展，中原地区先进的生产技术、经验，传入西域地区，促进了西域本地经济的发展，从而形成了西域与中原地区的经济互补性结构。当然，相互之间的社会文化交流也在日益频繁，如龟兹王从中原返回后，仿中原礼仪制度在龟兹实施。在中原文化制度对西域产生重大影响的同时，西域诸邦国的音乐、舞蹈也频频传入内地，从而为中华传统文化注入了新鲜血液。此时期，东西方物质文化交流达到了前所未有的程度，极大地丰富了中原和西域各族民众的生活所需，丝绸之路在各国使团和商贾的频繁而密切的往来影响之下日渐繁盛。
纵观西汉时期，丝绸之路在新疆主要分为南、北两道，敦煌或阳关是南、北两道东部起点。
丝路南道：从阳关西行，取道鄯善（今若羌一带），沿车尔臣河古代河岸西行抵且末，顺昆仑山北麓，经精绝（今民丰县尼雅遗址）、扜弥（今策勒县东北）、于阗（今和田附近）、皮山（今皮山县一带），至莎车（今莎车县）。再经蒲犁（今塔什库尔干），翻越葱岭（今帕米尔高原），可出大月氏（今阿富汗北）、安息（今伊朗）等国。南道越葱岭后，南经罽宾（今克什米尔），还可到达身毒（今印度）。
丝路北道：出敦煌西行，经横坑，绕过三龙沙（今疏勒河西端沙漠），横越白龙堆（今罗布泊东北岸盐碛地），先至楼兰古城，折而北行，至车师前王庭（今吐鲁番交河故城），之后沿塔里木盆地北缘，经尉犁、焉耆，到达龟兹（今库车县），再经姑墨、温宿（今乌什县境内），至疏勒（今喀什）。至此，继而西北行，翻越葱岭，出大宛，到达康居（今锡尔河以北地区）、奄蔡（今里海以北地区）等地区。
上述南、北两道，包含了丝路经过新疆的主要干线。由于北道易受匈奴攻击，所以商旅多行南道，南、北两道间还有许多小道连接。
在西汉末年，又开辟了一条新道，即出敦煌以后，不经过三龙沙和白龙堆，向北取道伊吾（今哈密），越过博格达山，经过车师后国（今吉木萨尔附近），再沿天山北路往西直到乌孙。此道为新北道，原来的北道变为中道。开辟新北道，意在避开三龙沙白龙堆之险，也与当时汉匈关系和缓有关系。
魏晋南北朝时期的丝绸之路
通常所讲的“魏晋南北朝”，是指220年到581年的一段历史。魏晋中“魏”指三国鼎立时期中国北方政权，一般称为“曹魏”，而“晋”是三国之后由司马氏建立的晋朝。
自304年刘渊与李雄分别称王建立了汉赵和成汉开始，中国北方各民族纷纷建立起雄霸一方的诸侯王国，直到439年，这些纷乱的局面才被鲜卑拓跋氏建立的北魏统一，历时共计135年。在此期间，入主中原的众多游牧民族以匈奴、羯、鲜卑、羌和氐为主，统称“五胡”，他们分别建立了多个不同王国，主要包括成汉（巴氐人李氏）、夏（匈奴赫连氏）、前赵（匈奴刘氏）、后赵（羯族石氏）、前秦（氐族苻氏）、后秦（羌族姚氏）、西秦（鲜卑族乞伏氏）、前燕（鲜卑族慕容氏）、后燕（鲜卑族慕容氏）、南燕（鲜卑族慕容氏）、北燕（汉族冯氏）、前凉（汉族张氏）、后凉（氐族吕氏）、西凉（汉族李氏）、南凉（鲜卑族秃发氏）、北凉（匈奴族沮渠氏）等十六国。实际上，这一时期的王国数目远不止16个，比如还有汉人冉闵建立的魏、鲜卑族慕容氏建立的西燕，以及北魏前身的代国，等等。因而，后世多统称这一时期为“五胡十六国”。
魏晋与十六国时期，国家政权更替频繁，文化交流频繁，在此期间，思想、文学、艺术等得到了很大发展。期间横贯亚欧大陆的丝绸之路，其东段节点止于中国西北部，大致在高昌地区（今新疆吐鲁番）。时光荏苒，北方十六国政权故地尽属北魏之后，离析了百余年之久的中华北方得以归一，在其后的北周王朝，也几乎尽囊北魏旧地，尤其是北周武帝朝国力盛极一时。在此政治格局下，相较于十六国时期而言，丝绸之路昔日的活力又被重新唤醒了，丝绸之路上的经济贸易、文化宗教等诸多交往都相对开始活跃起来。
在西域地区，自东汉末年以来中原动荡，中央王朝自顾不暇，放松对西域的控制之后，西域诸雄并争、互相兼并，最后形成了以鄯善、于阗、焉耆、龟兹、疏勒、乌孙及车师前、后王国为主的七国争雄局面，而史籍中所载的其他许多小国都并属于这七国。曹魏建立之后，西域诸国纷纷归附，再次臣属于中央。曹魏在高昌设置戊己校尉，屯田驻防；又在罗布泊西北的鄯善国设置西域长史，管辖西域诸国，西域地区再次稳定下来。西晋承袭了曹魏在西域的管理制度，不过当中原很快陷入战乱后，西域也进入相互争夺的动荡中。
西晋亡国，北方政权更迭频繁，河西地区又有五凉前后相继，在这一时期先后对西域进行管理或产生影响的只有前秦、前凉、后凉、西凉和北凉等几个政权。东晋后期，北方高原柔然汗国兴起，与北魏南北对峙。4世纪末，柔然统一蒙古高原，之后他们经营西域，出兵天山南北，一度控制了西域。423年，北魏太武帝即位后，北魏大军一路西征，先后灭北凉，大败吐谷浑，征服了西域诸国，于是西域大多归附了北魏。
此后西域诸国一直被北魏柔然等势力相互争夺。在魏晋南北朝数百年间，北方各游牧民族相继崛起，轮番控制西域。这期间亦有其他民族，诸如嚈哒、悦般、高车、吐谷浑等加入到这场争夺中。各民族间互相同化与融合，又形成了一个新的民族共同体——铁勒，而铁勒的出现又为其后突厥民族与突厥汗国的形成提供了条件。
南北朝时期曾经在吐鲁番盆地形成了以一个汉人为主体的王国，史称高昌王国。高昌王国的汉人族群是西汉以来由在车师前王国屯田的汉人逐渐定居繁衍形成的。魏晋时期，前凉在高昌设郡，管辖高昌地区。之后又由北魏统辖。北魏势衰，柔然便扶植汉人建立高昌王国的割据政权。5世纪末，高昌民众拥立汉人麴嘉为王，由此建立高昌国麴氏王朝，直至639年亡于唐朝，才被唐朝改置为西州。高昌地处丝绸之路的中点，在中西交往与丝路经贸以及文化传播过程中起过十分重要的作用。
法显与鸠摩罗什——东晋丝路上传播佛教的大师
魏晋时期，对中西方文化交流贡献之大者，必须提到东晋的两个僧人，一位是法显，另一位是鸠摩罗什。
大家最为熟知的前往西方天竺取经的人是唐僧，因为由唐玄奘西行求法故事演绎的名著小说《西游记》家喻户晓、妇孺皆知。其实，比唐玄奘大师还早了230年的东晋高僧法显，乃是我国第一位不远万里历经磨难域外取经的伟大僧人。
法显俗姓龚，337年出生于平阳郡武阳县（今山西临汾）。东晋隆安三年（公元399年）与慧景、道整、慧应、慧嵬等人结伴，自长安始发，穿过河西走廊，经敦煌、鄯善至焉夷（今新疆焉耆），继而往西南方向越北河抵达于阗（今新疆和田），后折返于今巴基斯坦境与阿富汗境，始至天竺（今印度）；而后又横穿尼泊尔至摩竭提国首都巴连弗邑留住三年（405—407年），在此学习佛教经典并拜会名僧。自此之后，法显开始取道海路只身回国，搭乘海上商船于410年到达狮子国（今斯里兰卡），曾驻足一年有余，续乘商船东归。途经耶婆提（今苏门答腊岛），后由此直达山东半岛牢山（今崂山）弃船登陆，在他75岁时历经艰难从海路返回，最后到达建康（今南京），顺利实现了自己的西行取法宏愿。期间历时14年，辗转30多个王国，取得佛经约12部60余卷。在随后的日子里，翻译了多部佛经，并将自己西行取经的见闻写成了一部《佛国记》，此书在世界学术史上占有重要地位，它作为传记文学杰作的同时，又是学界研究东晋时期西域和印度历史的重要史料。
据《佛国记》记载，法显一行人从长安出发，越陇坂、过乞伏氏西秦，出金城（今甘肃兰州西）溯湟水而上，过西平（今青海西宁）、翻越养楼山（今西宁北），出张掖镇（今张掖西北）到敦煌。复从敦煌西行，度越沙河。沙河可能是史籍所载白龙堆、三龙沙地界的沙漠泛称，也就是自敦煌以西到鄯善东界的沙漠地带。“沙河中多有恶鬼、热风，遇则皆死，无一全者”，可以想见其艰难。自后，法显一行到鄯善国（今若羌），逗留月余，再从鄯善往西北方向行进，经过15天跋涉，到达焉夷国（今焉耆）。继续向西南行进，穿越广袤的塔里木盆地，途径沙漠，前行艰难，“所经之苦，人理莫比”。经一月时日，方抵达于阗（今和田）。此后又从于阗出发，经子合国（今叶城西南），到达竭叉国（今塔什库尔干），此后法显一行度越葱岭，折返于今巴基斯坦与阿富汗境，最终到达天竺，距离出发时已经过去了数年，待其东归，已达14年之久。
另一位对中西方文化交流有着重要贡献的僧人是鸠摩罗什。他是东晋时后秦的高僧，也是历史上著名的佛经翻译家，精通各类佛教经典。在法显西行的两年后，即后秦弘始三年（401年），鸠摩罗什大师从西域龟兹国出发来到长安。他曾与弟子们翻译了大量的经律论传等，如佛经《大品般若经》《法华经》《维摩诘经》《阿弥陀经》《金刚经》等，共计有94部425卷之多，其影响颇为广泛，为佛教在中国的传播作出了重大贡献。然而，恰恰就在法显大师从天竺返回一年之后，即413年，鸠摩罗什高僧圆寂于长安草堂古刹（今西安草堂寺）。其后，在弟子们火化大师遗体时，发现舌根化为舌舍利子。这是世界上唯一一颗三藏法师舌舍利子，见证着鸠摩罗什对中西佛教文化交流和发展做出的万世之功。
就在同一历史时期内，曾西往东来于漫漫丝路上的法显与鸠摩罗什两位伟大高僧，彼此却始终无缘谋面，尽管有此遗憾，但他们有着共同的意志和信念，为佛教传播与弘扬作出的巨大贡献，使未曾谋面的这种遗憾变得不值一提。正是在这些大德高僧以及众多佛教信众的共同努力之下，佛教——这一起源于恒河上游的地方性宗教，通过诸多条类似于丝绸之路这样平凡而伟大的文明交往纽带，最终得以传遍世界，并深刻影响着世界，让世界文化变得丰富多彩。